又是一年开学季，有的小伙伴刚进入实验室，要投入忙碌而紧张的科研工作中了吧？
WB... 免疫组化... 免疫荧光...流式细胞...各种技术也是在勤学苦练当中吧？
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开学季技术大讲堂——（一）抗体相关基本知识
抗体(antibody)是生物体在抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白(Ig)。按抗体的来源，可将其分为天然抗体和人工制备的抗体，是通过对特定生物体免疫接种特定抗原物质后而获得。人工免疫动物制备的抗体应用甚为广泛，既可以用于科学研究，也可以用于疾病的预防、诊断和治疗。
一、抗体的基本结构
经x线晶体衍射结构分析发现，抗体Ig由四条多肽链组成，各肽链之间由数量不等的链间二硫键连接。Ig可形成“Y”字型结构，称为Ig单体，是构成抗体的基本单位。
（一）重链和轻链
天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain, H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain, L)。同一Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。
1. 重链分子量为50000～75000，由450～550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将抗体Ig分为5类(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE, 其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链，商品化的抗体绝大部分都是IgG。不同类的Ig具有不同的特征，如链内和链间二硫键的数量和位置、结构域的数量及铰链区的长度等均不完全相同。即使是同一类的Ig，其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数量、位置也不同，据此又可将同类Ig分为不同的亚类(subclass)。
IgG的亚类
利用不同种属动物制备的IgG存在不同的亚类，常见的不同种属IgG亚类如下：
• 兔: IgG（无亚类）
• 小鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3
• 大鼠: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgM
• 山羊: IgG1, IgG2
在进行某些抗体相关实验(如IF和FCM)的时候，我们常常需要仔细看一下所订购商品化抗体的IgG亚类，以方便我们选择同型对照(isotype control) IgG (即与目的蛋白抗体相同来源种属的相同类型正常IgG)作为抗体的阴性对照进行平行实验，以排除可能的非特异性染色结果。
2. 轻链分子量约为25000，由214个氨基酸残基构成。轻链可分为两种，分别为kappa(κ)链和lambda(λ)链。据此，可将lg分为两型(type)，即κ型和λ型，一个Ig分子上两条轻链的型别总是相同的。生物体内可同时存在κ型和λ型的Ig分子，不同种属生物体内两型轻链的比例不同。正常人血清Ig的κ: λ约为2:1，而在小鼠则为20:1。根据λ链恒定区个别氨基酸的差异，又可将λ链分为λl、λ2、λ3和λ4四个亚型(subtype)。
（二）可变区和恒定区
通过分析不同Ig重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将Ig轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region, V区)，占重链1/4，占轻链1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region, C区)，占重链3/4，占轻链1/2。
1．可变区 重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region, HVR)或互补决定区(complementarity determining region, CDR), 包括HVR1(CDR1)、HVR2(CDR2) 和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH的3个高变区分别位于29～31、49～58和95～102位氨基酸，而VL的3个高变区分别位于28～35、49～56和91～98位氨基酸。VH和VL的3个CDR共同组成Ig的抗原结合部位(antigen binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。
2．恒定区 重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3, 而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
（三）铰链区
铰链区(hinge region)位于CH1与CH2之间，富含脯氨酸，易伸展弯曲，从而改变抗原结合部位之间的距离，有利于抗体结合位于不同位置的抗原表位。铰链区易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解，产生不同的水解片段。
二、抗体的制备流程
利用生物体对抗原物质产生免疫应答并产生抗体的机制，选用特定抗原物质对机体持续刺激使其产生大量特异性抗体，之后收集纯化得到针对特定抗原的特异性抗体，这一过程就是抗体制备。抗体制备主要步骤包括：获得理想免疫原、免疫动物、分离血清、纯化抗体和抗体应用检测，我们在此主要介绍获得理想免疫原、抗体的克隆性和抗体纯化的一些细节。
（一）获得理想免疫原
制备抗体首先要获得理想免疫原，通常免疫原可以是各种形式，不过理想的免疫原则需要进一步的准备。
1. 蛋白类抗原：对于天然易获取的蛋白可以纯化后直接作为免疫原；对于天然含量较少或难以提取的蛋白，可以通过基因工程重组表达的方式获取。同时也可以选择蛋白的特定的连续片段做多肽合成作为抗原，较短的多肽是半抗原，通常免疫原性较弱，需要进一步偶联载体蛋白(可选KLH、BSA、OVA)才能作为免疫原。
2. 小分子化合物：化合物抗原同样是半抗原，也需要进一步偶联载体蛋白才能作为免疫原。为了便于偶联载体蛋白，特定的化合物还需要进行分子改造以便能成功偶联。
3. 病原体：灭活的病毒或细菌可以直接作为免疫原。
免疫应答过程
1. 抗原进入机体
2. 抗原刺激 B淋巴细胞，使之分化增殖成为抗体分泌浆细胞和记忆细胞（初次免疫应答）
3. 抗体主要由浆细胞分泌
4. 记忆细胞再次受到特异性抗原刺激后会被激活而成为分泌抗体的浆细胞（再次免疫应答）
5. 记忆B细胞是长命细胞，可以存活数月甚至机体终生
抗原
是一类在适合条件下能激发机体免疫系统发生免疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质（抗体和效应细胞）在体内或体外发生特异性结合反应的物质。
抗原具有两种性能：
• 免疫原性( immunogenicity) : 指抗原分子具有诱导机体产生免疫应答的特性。
• 反应原性( reactogenicity) : 指抗原分子与抗体或效应 T 细胞等免疫应答产物发生特异性反应的特性。
抗原决定簇(antigenic determinant)
指抗原上那部分可以引起机体产生抗体的具有特殊立体构型和免疫活性的分子结构和化学基团，叫做抗原决定簇。由于抗原决定簇通常位于抗原分子表面，因而又被称为表位(epitope)。
抗原决定簇决定着抗原的特异性，即决定着抗原与抗体发生特异结合的能力。抗原决定簇多位于蛋白质的表面，一个蛋白质大分子常有许多抗原决定簇。抗原决定簇依赖于氨基酸序列和空间构象两种因素，又分为线性决定簇(Linear determinants)、构象决定簇(conformational determinants)和新生抗原决定簇(Neoantigenic determinant)。
•线性决定簇(Linear determinants): 又称为顺序决定簇(sequential determinants) 或连续决定簇(continuous determinants)，是抗原中直接由分子基团的一级结构序列构成的决定簇。
•构象决定簇(conformational determinants): 又称为不连续决定簇(discontinuous determinants)，是抗原中由分子基团间特定的空间构象构成的决定簇，一般是由分子中不连续的若干肽链盘绕折叠而构成。
• 新生抗原决定簇(Neoantigenic determinants): 通常是由于蛋白酶的切割活化以后才会出现的抗原决定簇，尤其是与一些蛋白和酶（如Caspase、insulin等）的加工和活化形式对应。
（二）抗体的克隆性(Clonity)
一个抗原上可以有好几个不同的抗原决定簇，因而使机体产生好几种不同的抗体，最终产生出抗体是浆细胞。只针对一个抗原决定簇起作用的B细胞群或浆细胞群就是一个纯系，纯系的英文为Clone，音译就是克隆。由一种B细胞群或浆细胞克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一种抗原刺激机体，也存在多种抗原决定簇，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。
单克隆抗体和多克隆抗体产生区别示意图
（三）抗体的纯化
我们知道，一般免疫血清中含有特异性抗体和非特异性抗体，血清蛋白以及其他各种杂蛋白等，在制备特异性抗体过程中当抗体的效价达到实验预期之后，需要对免疫血清进行纯化提取得到效价更高，特异性更强，稳定性更好的抗体。
目前，大多数商品化抗体使用Protein A或Protein G进行纯化。由于protein A或protein G 可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合。Protein A或protein G 作为配基可以被偶联到琼脂糖凝胶上，当抗血清从中流过时，特异性的IgG就与配基结合，其他杂蛋白则穿流而过。因两种蛋白纯化抗体时对不同宿主的抗体的结合能力不同，我们需要具体情况，分别选择protein A 或protein G, 或者是protein A/protein G组合。一般兔抗（包括单克隆蛋白与多克隆抗体）、小鼠单抗IgG2a、IgG2b、IgG3, 选择用protein A纯化；而小鼠、大鼠和山羊的多克隆抗体、小鼠单抗IgG1、大鼠单抗，则选择用protein G纯化。
