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科研大神说,Western Blot是研究僧的劳斯莱斯...-北京博奥森生物技术有限公司
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科研大神说,Western Blot是研究僧的劳斯莱斯...
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2020-5-22

 
 生物届有一句名言——Western Blot是研究僧的劳斯莱斯。

Western Blot蛋白印迹)虽然是科学研究中最为基础平常的实验,其背景里却蕴含了很多知识,操作过程中也有许多trick,可以说“好的WB结果是顺利毕业的一半”。
 

1.蛋白样品制备——千万别garbage in,garbage out

A: 蛋白提取:裂解要快速彻底,先变性后保存,在不影响后续实验的情况下尽量选择较强的裂解液 (RIPA裂解液);蛋白提取要在低温条件下进行,防止蛋白自溶或降解,同时可以加入适当的蛋白酶抑制剂以减少蛋白酶的水解作用。磷酸化蛋白提取还需加入蛋白磷酸酶抑制剂,以防止蛋白去磷酸化。

B: 蛋白定量:确定合适的上样量,最常用的为BCA法 (BCA蛋白定量试剂盒)。


2.电泳SDS-PAGE——合适即完美

A: 制备上样样品:根据实验要求,选择变性/非变性上样缓冲液,上样前可以适当离心。

B: 配制聚丙烯酰胺凝胶:根据蛋白分子量的大小选择合适的胶浓度,蛋白分子量小应选择高浓度的胶,蛋白分子量大则选择低浓度的胶;TEMED和APS促进凝胶反应,一般先加TEMED,后加APS;常温下半小时胶可凝固,若天气寒冷或需加快凝固,可将其置于37℃孵箱中加速凝固;胶最好现配现用,如果需要短暂保存,要用湿润的保鲜膜包好并置于4℃冰箱中。

C: 配制电泳缓冲液:内槽电泳缓冲液要现配现用。

D: 根据蛋白分子量选择合适的预染Marker

E: 浓缩胶电压一般采用100V左右,待溴酚蓝迁移出浓缩胶后再换为200V。

3.转膜——小手抖一抖,条带变没有


A: 胶在负极,膜靠近正极;为防止短路,滤纸不要大过膜【“三明治夹心”如图示】,夹好膜和凝胶后,确保凝胶、膜和滤纸之间无气泡,否则会导致转膜不完全。

B: 转膜缓冲液要提前冷却,且胶要在转膜缓冲液里平衡一下,防止胶变形,同时有助于去除影响转膜的杂质;转膜全程带手套操作,避免手印污染影响结果;膜上可以剪一个小角用来标记正反面。

C: 湿转法转膜的电流一般在200-400mA之间,转膜时间为30-60分钟,也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据蛋白的分子量大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,分子量越小则需要的转膜时间越短。

D: 可使用丽春红染色液初步检测转膜效率,它与下游WB检测完全兼容,无任何干扰。染色后可以用蒸馏水,PBS或者其他溶液洗去。可用于PVDF膜硝酸纤维素膜 (NC膜)和醋酸纤维素膜上蛋白的检测,不适用于尼龙膜上的蛋白检测。


4.免疫印迹——接下来就是见证奇迹的时刻

A: 常见的封闭液有5%脱脂奶粉BSA封闭液,磷酸化蛋白使用BSA作为封闭液, 脱脂奶粉会对磷酸化蛋白检测有影响。

B: 封闭时间和封闭液剂量要足够,封闭不充分显色背景会过深;洗膜时间要适当,一般用TBST洗涤5min×3次,过度洗膜会使信号减弱;抗体的稀释倍数按照产品说明书和实验要求进行适当调整,抗体浓度不宜过高。

C: 显色:一般使用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法,A、B发光液按比例稀释混合,现配现用。不同蛋白最佳曝光时间不同,如果同一张膜上不同样品信号差异太大,可以尝试将膜剪开再分别进行曝光。

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蛋白免疫印迹(WB)实验流程及配套试剂


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