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你不得不收藏的抗体偶联物选择指南-北京博奥森生物技术有限公司
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你不得不收藏的抗体偶联物选择指南
发表者:北京博奥森生物      发表时间:2022-5-12


       免疫学实验已经成为蛋白质科学研究领域难以替代的重要实验方法。通过将“可以与待测分子结合的特异性抗体”和“易于被检测到的标记物”二者相偶联的方法,研究人员已经获得了高效且特异检测样本中靶标的有效工具。而且随着检测手段的更新迭代,越来越多的标记物类型也花样翻新,大有“乱花渐欲迷人眼”之势。那么,如何才能在种类繁多的抗体偶联物中找到合适自己的那一个呢?今天就让我们为你拨开迷雾,一探究竟。


  其实,作为标记的偶联物种类虽多,但其实最常用偶联物只有3个大类,即:酶标记、荧光标记和生物素标记。

       酶标记的首选毫无疑问是辣根过氧化物酶 (HRP) 。HRP能通过催化有过氧化氢参与的一系列氧化还原反应并释放信号,而被广泛应用于免疫印迹 (WB), 酶联免疫吸附 (ELISA), 以及免疫组织化学 (IHC) 等实验中。由于HRP自身稳定性强且催化效率高,因此可以通过很简单的操作,有效放大中低丰度靶标的信号,因此能够适应大多数检测情境。酶标记中的另外一种是碱性磷酸酶 (AP) 标记,常常是通过催化磷酸酯底物的去磷酸化显色反应而达到检测目的。与HRP相比,AP标记过程中酶活性损失更大、稳定性低且反应时间长,因此对制备和检测操作都提出了较高要求。但是得益于AP独特的最适pH和催化稳定性,这使得AP在碱性条件或对结果稳定性要求苛刻的特殊场合下,具有比HRP更好的工作性能。


  HRP标记往往是样本单靶点检测的首选,但当需要对同一样本中的多个靶点进行多通道检测时,荧光标记抗体则提供了一种更好的选择。各类荧光标记,如:AF系列、Cy系列、FITC、罗丹明等为研究人员们提供了极大地选择空间,因此被广泛应用于免疫荧光染色 (IF), 流式细胞术 (FC), 和荧光免疫印迹 (FWB)实验中。选择荧光标记时,荧光相对强度和光谱分离度的选择最为重要。由于激光光源、检测设备等的不同,不同的荧光标记在不同的设备上具有不同的荧光强度。因此,选择荧光标记物时,需要结合实验室设备的特点和蛋白丰度,以确保最亮的标记物和表达水平最低的蛋白相互组合。此外,“串光”问题会在荧光实验中带来非常大的不利影响,并直接影响结果的可信度。因此,荧光标记物发射光谱应尽可能地彼此远离,以避免邻近通道间荧光信号的串扰。如果难以确认最佳荧光标记的种类,优先去尝试AF488, Cy5, FITC, PE等文献中最常用到的荧光标记通常是较为稳妥的选择。

        和荧光与酶标记不同,生物素标记由于不能直接释放信号而很少被独立使用,但是却常出现在各类免疫学实验应用场景中。得益于生物素与各类亲和素高特异性且强力地结合,生物素标记抗体可以添加在原有的一抗和二抗之间(此时生物素化抗体成为二抗,而原先的二抗被三抗或标记的亲和素取代),随后被标记亲和素和生物素标记的结合,可以使低丰度靶标的信号被进一步放大,进而提升检测的信噪比。因此,当我们关心的靶蛋白丰度过低,以至于传统的标记物难以对其进行有效的检测时,生物素化抗体往往能力挽狂澜,成为我们实验成功的一根救命稻草。如果与时下流行的酪胺信号放大技术 (TSA) 相结合,生物素化抗体甚至能为我们提供前所未有的清晰而明亮的荧光成像。

 好的开始是成功的一半,辛苦实验的你不需要为选择标记抗体而苦恼。给博奥森一份信任,我们还你的不只是一支好抗体!


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