被审稿人一句“请补充对照”打回，多半是这几个坑没避开（下）

1.同型对照：同型对照须尽可能与一抗同种属、同亚型（IgG1/IgG2a/IgG2b/IgM）、同浓度、同标记方式，且确认不与靶标结合。浓度不匹配，对照就失去意义。

2.阳性对照：阳性对照要与实验样本同物种、同固定条件、同处理流程；批次稳定、可追溯、可重复；表达谱要经过文献或表达数据库确认。弱阳性样本是灵敏度的标尺——它能染出来，说明你的体系确实够灵敏；强阳性样本用于验证整套染色体系完整可用，排查实验流程完全失效的情况。注意：强阳性易发生信号饱和，无法评估体系对低丰度靶点的检出能力。免疫相关指标常用扁桃体、淋巴结、脾脏等免疫细胞富集组织作为阳性对照。

3.阴性对照：生物学阴性样本对照：选用经文献、蛋白表达数据库证实生理条件下不表达靶蛋白的组织/ 细胞，或采用CRISPR‑KO 完全敲除靶基因的样本。经蛋白表达水平验证的体外培养细胞系KD样本，也可以作为WB实验的阴性样本；省略一抗只是“空白对照”，只能排除二抗和检测系统的背景；抗体Fc段非特异性结合要靠同型对照来排除；内源性酶、自发荧光要靠背景对照排除。

4.阳性、阴性对照应与待测样本采用同一批试剂、完全一致的处理流程；尽量同批次染色，保证实验条件对等。

核心口诀：阳性对照看体系，阴性对照看特异性，同型对照看背景，空白对照看检测系统，自发荧光看本底，单色对照看光谱。